Canine visceral leishmaniasis in area with recent Leishmania transmission: prevalence, diagnosis, and molecular identification of the infecting species

Abstract INTRODUCTION: Canine visceral leishmaniasis (CVL) is an endemic disease in Brazil, and integrated control actions have been adopted by the Brazilian Ministry of Health to control its spread. However, the transmission profile is unknown in areas with recent CVL cases, including Itaúna, located in the Brazilian state of Minas Gerais, where the present study was carried out. METHODS: A total of 2,302 dogs from 12 neighborhoods were serologically tested for canine VL using the current diagnostic protocol adopted by the Brazilian Ministry of Health. Test positivity rate (TPR) and CVL prevalence were determined for each neighborhood. The presence of Leishmania was assessed in 60 seropositive dogs which had been recommended for euthanasia. Twenty-two of them (37%) were asymptomatic, and 38 (63%) were symptomatic for CVL. Parasitological (myeloculture and smear/imprint) and molecular (PCR) methods were employed for Leishmania detection in bone marrow, spleen, mesenteric lymph nodes, and ear skin. The infecting Leishmania species was identified by DNA sequencing. RESULTS: CVL prevalence (per 1,000 dogs) varied from 0.0-166.67, depending on the neighborhood, with a mean of 68.96 (SD 51.38). Leishmania DNA was detected in at least one tissue from all seropositive dogs, with comparable TPR among tissues. Leishmania parasites were identified in most (54/60) seropositive dogs, and the infecting parasite was identified as Leishmania infantum in all of these. CONCLUSIONS: Prevalence of CVL is a contributor to the spread of visceral leishmaniasis in Itaúna.

Seasonality of sand flies (Diptera: Psychodidae) and Leishmania DNA detection in vector species in an area with endemic visceral leishmaniasis

BACKGROUND Leishmaniases are a serious health problem in southeast Brazil, including the city of Belo Horizonte (BH), Minas Gerais state (MG), where there are high rates of incidence and mortality due to visceral leishmaniases. BH is divided into nine sanitary districts (SD) of which one, the Venda Nova SD, was selected for this study because it has high rates of positivity for canine leishmaniasis and high incidence of human leishmaniasis. OBJECTIVES This study aimed to survey the sand fly fauna in Venda Nova SD from August 2011 to July 2013 and perform a descriptive analysis of the vector population. METHODS The sampling was carried out using automatic HP light traps at all covered areas of the Venda Nova SD, in a total of eighteen light traps. Sampled specimens were identified following Galati (2003), and females were submitted to molecular techniques for the detection and identification of Leishmania DNA. A simple environmental description was done for it area and Kernel estimation was used to infer vector density for each study site. FINDINGS A total of 2,427 sand fly specimens belonging to eight species and five genera were collected of which 95.3% were Lutzomyia longipalpis. The seasonal variation curve was delineated by this species. Lu. longipalpis was the most abundant at all collection points and in all months of the study, and exhibited a natural infection rate of 1.01% for Leishmania infantum and 1.77% for Leishmania braziliensis. MAIN CONCLUSIONS The results show the presence and adaptation of Lu. longipalpis to the anthropic environment of BH and reinforces its role as the main vector of L. infantum in the region.

Estudo da variabilidade genética de Leishmania (Viannia) braziliensis Vianna, 1911 de diferentes regiões do Brasil

Leishmania (Viannia) braziliensis é a espécie mais prevalente nos casos humanos da leishmaniose tegumentar nas Américas. Polimorfismo genético têm sido encontrado em populações naturais de diferentes espécies de Leishmania, o que explicaria a adaptação destes parasitos às mudanças observadas nas condições ambientais. Neste estudo utilizou-se um painel significativo de isolados L. braziliensis de focos de LTA de diferentes regiões geográficas e biomas do Brasil. Os polimorfismos do DNA genômico foram analisados utilizando-se diferentes marcadores genéticos, comparou-se a variabilidade genética intra-específica das amostras e determinou-se as relações fenéticas entre elas. Na eletroforese de isoenzimas (MLEE), a maioria das amostras (87,3%) apresentou o perfil de migração idêntico ao da cepa padrão de L. braziliensis (M2903); 8 amostras (10,2%) apresentaram apenas um eletromorfo diferente para a enzima IDHNADP. Duas amostras (2,6%) apresentaram o perfil mais heterogêneo, com padrões diferentes de L. braziliensis para 3 enzimas (G6PDH, IDHNADP e MDH). Estas amostras foram designadas como variantes. Para o RAPD-PCR com o iniciador M1340F pode-se observar que o conjunto dos isolados formaram claramente dois grandes clusters, pela análise com o programa NTSYS, refletindo a diversidade genética entre as amostras de L. braziliensis testadas. A análise dos perfis gerados pela SSR-PCR evidenciou que os iniciadores CARY e K7 foram capazes de mostrar variabilidade intra-específica. Observou-se que com o iniciador CARY, as amostras agruparam-se em um clustrer, incluindo a cepa de referência de L. braziliensis. Por outro lado, com o iniciador K7 observou-se a formação de dois clusters.

Uma árvore consenso foi gerada por parcimônia com os dados concatenados dos três marcadores utilizados (M1340F, CARY e K7) e observou-se a formação de dois clusters onde a maioria das amostras do bioma Amazônia /região Norte (58%) e região Nordeste (62%) estão juntas em um grupo e o bioma Cerrado /região Centro-Oeste (100%), Cerrado e Mata Atlântica (67%) e a região Sul (80%) estão em outro grupo, o que concorda com a análise feita pelo método de distância genética. Foram encontrados dois perfis para ITS1- HAEIII e após a análise dos géis foram identificados três perfis para hsp70-BstUI. Observou-se que o índice de similaridade médio entre as amostras para os testes de isoenzimas, RAPD-PCR com o iniciador M1340, SSR-PCR com o iniciador CARYe K7 foi de aproximadamente 70%, demonstrando a existência de variabilidade de L. braziliensis confirmada através das diferentes técnicas utilizadas. Combinando os resultados da análise por biomas e por região, podemos dizer que a maioria das amostras do bioma Amazonas, região Norte e bioma Caatinga estão sempre agrupadas em um mesmo clustere o bioma Cerrado, região centro-oeste em outro cluster. Este estudo refletiu a diversidade genética existente em L. braziliensis sugerindo a possibilidade de uma associação entre variabilidade e origem geográfica

Estudo da variabilidade genética de Leishmania (Viannia) braziliensis Vianna, 1911 de diferentes regiões do Brasil / Study of genetic variability of Leishmania (Viannia) braziliensis Vianna, 1911 from different regions of Brazil

Leishmania (Viannia) braziliensis é a espécie mais prevalente nos casos humanos da leishmaniose tegumentar nas Américas. Polimorfismo genético têm sido encontrado em populações naturais de diferentes espécies de Leishmania, o que explicaria a adaptação destes parasitos às mudanças observadas nas condições ambientais. Neste estudo utilizou-se um painel significativo de isolados L. braziliensis de focos de LTA de diferentes regiões geográficas e biomas do Brasil. Os polimorfismos do DNA genômico foram analisados utilizando-se diferentes marcadores genéticos, comparou-se a variabilidade genética intra-específica das amostras e determinou-se as relações fenéticas entre elas. Na eletroforese de isoenzimas (MLEE), a maioria das amostras (87,3%) apresentou o perfil de migração idêntico ao da cepa padrão de L. braziliensis (M2903); 8 amostras (10,2%) apresentaram apenas um eletromorfo diferente para a enzima IDHNADP. Duas amostras (2,6%) apresentaram o perfil mais heterogêneo, com padrões diferentes de L. braziliensis para 3 enzimas (G6PDH, IDHNADP e MDH). Estas amostras foram designadas como variantes. Para o RAPD-PCR com o iniciador M1340F pode-se observar que o conjunto dos isolados formaram claramente dois grandes clusters, pela análise com o programa NTSYS, refletindo a diversidade genética entre as amostras de L. braziliensis testadas. A análise dos perfis gerados pela SSR-PCR evidenciou que os iniciadores CARY e K7 foram capazes de mostrar variabilidade intra-específica. Observou-se que com o iniciador CARY, as amostras agruparam-se em um clustrer, incluindo a cepa de referência de L. braziliensis. Por outro lado, com o iniciador K7 observou-se a formação de dois clusters.

Uma árvore consenso foi gerada por parcimônia com os dados concatenados dos três marcadores utilizados (M1340F, CARY e K7) e observou-se a formação de dois clusters onde a maioria das amostras do bioma Amazônia /região Norte (58%) e região Nordeste (62%) estão juntas em um grupo e o bioma Cerrado /região Centro-Oeste (100%), Cerrado e Mata Atlântica (67%) e a região Sul (80%) estão em outro grupo, o que concorda com a análise feita pelo método de distância genética. Foram encontrados dois perfis para ITS1- HAEIII e após a análise dos géis foram identificados três perfis para hsp70-BstUI. Observou-se que o índice de similaridade médio entre as amostras para os testes de isoenzimas, RAPD-PCR com o iniciador M1340, SSR-PCR com o iniciador CARYe K7 foi de aproximadamente 70%, demonstrando a existência de variabilidade de L. braziliensis confirmada através das diferentes técnicas utilizadas. Combinando os resultados da análise por biomas e por região, podemos dizer que a maioria das amostras do bioma Amazonas, região Norte e bioma Caatinga estão sempre agrupadas em um mesmo clustere o bioma Cerrado, região centro-oeste em outro cluster. Este estudo refletiu a diversidade genética existente em L. braziliensis sugerindo a possibilidade de uma associação entre variabilidade e origem geográfica